Проточная цитометрия: основы, принцип работы и применение в современной медицине

Проточная цитометрия — это широко используемый лазерный метод анализа клеток, позволяющий измерять экспрессию поверхностных и внутриклеточных молекул.

Метод применяется для одновременного многопараметрического анализа отдельных клеток в гетерогенных клеточных популяциях.

Основные возможности проточной цитометрии:

• определение различных типов клеток в смешанных популяциях
• анализ экспрессии белков на поверхности и внутри клетки
• оценка размера и объема клеток
• определение чистоты выделенных клеточных субпопуляций
• анализ клеточного цикла и жизнеспособности клеток

Одним из важных применений является флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS). В этом случае специальный прибор — клеточный сортер — разделяет клетки на основе их флуоресцентных и физических характеристик, позволяя собрать нужные клетки для дальнейшего исследования.

Проточный цитофлуориметр основан на измерении интенсивности флуоресценции, возникающей при связывании флуоресцентно-меченных антител с клеточными молекулами.

Флуоресцентные красители или антитела могут:

• связываться с белками на поверхности клетки
• проникать внутрь клетки и связываться с внутриклеточными белками
• связываться с ДНК (например, пропидий йодид)

Когда клетки проходят через лазерный луч, флуорофоры возбуждаются и излучают свет определённой длины волны. Этот сигнал фиксируется системой детекторов.

Подготовка образцов

Перед анализом необходимо подготовить одноклеточную суспензию.

Основные этапы подготовки:

1. Получение клеток из культуры, крови, костного мозга или тканей.
2. Разделение образца на отдельные клетки.
3. Инкубация клеток с антителами (мечеными флуорофорами или немечеными).
4. Анализ окрашенных клеток на проточном цитометре.

Окрашивание антителами является основным способом обнаружения специфических антигенов.

Мультицветная проточная цитометрия

Современные приборы позволяют одновременно измерять несколько параметров. Это называется мультицветной проточной цитометрией.

Используются различные флуоресцентные маркеры:

• флуоресцентные белки
• флуоресцентные красители
• флуоресцентно-меченные антитела

Это позволяет:

• различать разные типы клеток
• анализировать иммунные клетки
• оценивать чистоту клеточных субпопуляций
• исследовать форму и размер клеток

Например, различные поверхностные маркеры используются для идентификации популяций иммунных клеток.

Основные компоненты проточного цитометра

Флюидическая система

Флюидическая система направляет клетки через прибор.

Клеточная суспензия вводится в поток оболочечной жидкости (sheath fluid). За счет гидродинамической фокусировки клетки выстраиваются в один ряд и проходят через лазерный луч по одной.

Оптическая система

Оптическая система обеспечивает возбуждение флуоресценции и регистрацию сигналов.

Она включает:

• лазеры
• зеркала
• фильтры
• детекторы

Когда клетка проходит через лазер:

• происходит рассеяние света
• возбуждаются флуоресцентные молекулы

Детекторы

Свет, испускаемый клеткой, проходит через систему зеркал и фильтров и поступает на детекторы — фотоумножительные трубки (PMT).

PMT преобразуют световые сигналы в электрические, которые затем анализируются программным обеспечением.

Рассеяние света: FS и SS

Проточная цитометрия измеряет два основных типа рассеянного света:

Forward Scatter (FS)

• измеряется в направлении лазера
• коррелирует с размером клетки

Side Scatter (SS)

• измеряется под углом 90°
• отражает гранулярность и внутреннюю структуру клетки

Различие клеточных популяций по FS и SS

По параметрам FS и SS можно различать типы клеток, например, в крови.

Гранулоциты

• крупные и сильно гранулированные
• высокий FS и высокий SS

Моноциты

• крупные клетки
• высокий FS, но меньший SS

Лимфоциты

• небольшие клетки
• низкий FS и низкий SS

На графике каждая точка соответствует одной клетке.

Измерение флуоресценции

Если клетки окрашены флуоресцентными антителами, лазер возбуждает флуорофоры, и они испускают свет определённой длины волны.

Примеры:

• FITC — около 519 нм
• PE — около 575 нм

Каждый флуорофор детектируется своим каналом.

Оптические фильтры

Для разделения различных длин волн используются фильтры:

Band-pass фильтры (BP)
Пропускают свет в узком диапазоне длин волн.

Short-pass фильтры (SP)
Пропускают свет короче определённой длины волны.

Long-pass фильтры (LP)
Пропускают свет длиннее заданной длины волны.

Дихроичные зеркала (dichroic mirrors)
Разделяют световые потоки, отражая одни длины волн и пропуская другие.

Сортировка клеток (FACS)

В режиме FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) прибор может не только анализировать, но и сортировать клетки.

Процесс:

1. Клетка проходит через лазер.
2. Определяются её параметры (FS, SS, флуоресценция).
3. Капля жидкости с клеткой получает электрический заряд.
4. Электрическое поле направляет каплю в нужную пробирку.

Это позволяет получать чистые популяции клеток для дальнейших исследований:

• молекулярной биологии
• культивирования клеток
• функциональных тестов

Анализ данных

Специальное программное обеспечение анализирует данные проточной цитометрии.

Используются методы гейтирования (gating) для:

• выделения клеточных популяций
• оценки жизнеспособности клеток
• анализа экспрессии белков и генов
• определения фаз клеточного цикла